CID 54 Méthodes expérimentales, concepts et instrumentation en sciences de la matière et en ingénierie pour le vivant

III. Micro et nanosystèmes pour la biologie et le vivant

De par leur nature intrinsèque (la taille des dispositifs, leur richesse fonctionnelle, leur reproductibilité et souvent leur faible coût de fabrication), les micro et nanotechnologies ouvrent une fenêtre particulièrement pertinente pour le développement d'outils analytiques permettant de sonder et d'explorer aux niveaux les plus bas, moléculaires ou cellulaires, avec des résolutions et précisions remarquables, les mécanismes du vivant. Elles bousculent les approches et proposent des chemins pertinents pour l'étude des mécanismes fondamentaux et constitueront à terme un accélérateur de la recherche médicale.

Quel que soit l'objectif applicatif poursuivi, les défis majeurs restent encore d'identifier les espèces d'intérêt avec des seuils de détection ultra-sensibles (bien inférieurs au nanomolaire) avec ou sans marquage de l'analyte cible, mais également de manipuler (prélever, traiter, conditionner) des échantillons biologiques complexes (concentration, purification, immobilisation, tri, culture...). Les systèmes aboutis multifonctionnels, plus complexes, plus intégrés, plus intelligents offriront des solutions très performantes pour le diagnostic et le suivi thérapeutique (compagnon thérapeutique) ou l'environnement, répondant à des attentes sociétales majeures. La communauté française bénéficie pour ce faire d'une infrastructure technologique de pointe (Réseau des grandes centrales technologiques RENATECH) largement ouvertes aux besoins extérieurs et travaillant en excellente connexion avec les laboratoires de biologie et les cliniciens. Le GDR 3305 « Micro Nano Systèmes, Micro Nano Fluidique » rassemble cette communauté et contribue largement à l'établissement de l'interdisciplinarité requise.

A. Biosenseurs ou biocapteurs

Un biocapteur est un dispositif, conçu pour transformer un phénomène (bio)chimique en un signal mesurable. Il combine un composant biologique appelé « récepteur » et un « transducteur » représentant le mode de détection. Le domaine des capteurs et biocapteurs connaît un véritable foisonnement. Il s'agit d'un secteur typiquement interdisciplinaire où la chimie de surface se combine à la physique (optique, microélectronique), à la biologie, à la bio-informatique et au biomédical. Les biocapteurs enzymatiques avec détection électrochimique sont encore, à l'heure actuelle, les plus étudiés. Cependant, au cours des deux dernières décennies, le développement de biocapteurs basés sur des phénomènes optiques (résonance plasmonique de surface, interférométrie), électriques et mécaniques a grandement contribué à l'amélioration de leur sensibilité et spécificité, à la baisse du coût, et a facilité le criblage haut débit.

Le développement de prototypes portatifs est en pleine explosion. Le défi est de réaliser des dispositifs compacts, autonomes et automatiques capables d'analyser avec fiabilité des spécimens environnementaux, cliniques, vétérinaires, pathologiques ou médicaux dans des conditions difficiles, sur le terrain, en continu (temps réel) et dans les milieux ambiants (l'air, les fluides corporels, la nourriture...), peu coûteux, rapides, stérilisables et jetables (ou réutilisables). Les travaux actuels concernent l'immobilisation des éléments biologiques et la fonctionnalisation de surface (surfaces micro ou nano structurées par auto-assemblage ou par lithographie), mais également les transducteurs toujours plus sensibles, éventuellement jusqu'à la molécule unique pour s'affranchir des effets de moyennages et obtenir une sensibilité ultime en « comptant » les molécules (détection par voie optique, électrochimie, effet de champ, masse).

Les techniques de détection actuelles se tournent également vers l'étude des événements et mécanismes jusqu'au niveau cellulaire (membranaire ou intra-cellulaire, par exemple en utilisant les hyper-fréquences), si possible sans en affecter le fonctionnement, voire générer de morbidité.

B. Biopuces

Les biopuces très largement utilisées depuis plus de vingt ans, sont devenues un outil d'analyse multiplexé, haut débit, d'interactions entre une sonde fixée sur support et une cible (analyte) en solution, marquée ou non, et extraite de systèmes biologiques. Les sondes sont des biomolécules de natures différentes (protéines, peptides, ADN, cellules, sucres, tissus...). De nos jours, les biopuces sont abondamment utilisées dans les laboratoires pour des applications aussi variées que l'étude de l'expression des gènes, le génotypage, les interactions protéines-protéines ou protéines-sucres, la recherche d'inhibiteurs enzymatiques, de molécules chimitoxiques, l'impact d'effecteurs exogènes sur des cellules ou encore l'effet d'ARN dit interférent sur des cellules transfectées etc. De par leurs applications variées, les biopuces sont utilisées dans de nombreux domaines tels que la recherche fondamentale et pharmaceutique, le diagnostic médical, le contrôle agroalimentaire et industriel, l'environnement, les armes biologiques, etc.

La recherche se focalise à l'heure actuelle sur une troisième génération de biopuces pour le séquençage de masse, basée sur le séquençage d'une seule molécule d'ADN (Single Molecule Sequencing ou SMS). Contrairement à la deuxième génération, aucune amplification de l'ADN (ou ARN) n'est nécessaire pour effectuer le séquençage. Une seule molécule est lue. On peut donc également séquencer de l'ARN sans devoir le convertir au préalable en ADN complémentaire. Plusieurs approches très interdisciplinaires, telles que la technique dite « nanopores » qui combine de la fabrication ultime ou la biochimie de canaux ioniques et des mesures électrochimiques bas bruit, sont actuellement étudiées. Elles tirent également parti des matériaux émergents comme le graphène qui devrait permettre une amplification du signal de par la faible épaisseur du canal ionique ou du couplage entre des nanotransistors et les brins uniques d'ADN. Toutefois, les rendements ne sont pas, à l'heure actuelle, compatibles avec une commercialisation de ces techniques.

Le développement des puces à protéines se développe également mais s'avère plus problématique, car le monde des protéines est bien plus complexe. Ainsi pour réaliser des biopuces à protéines, il faut disposer de surfaces sur lesquelles les protéines puissent se fixer sans dénaturation, ce qui modifierait leur configuration spatiale et détruirait leurs fonctions et dans une orientation appropriée pour que les sites de fixation soient accessibles. Pour les biopuces à peptides, qui habituellement ne possèdent pas les particularités tridimensionnelles nécessaires à la reconnaissance, cette étape est moins critique. Ainsi les obstacles à franchir restent-ils nombreux pour les puces à protéines et l'avenir appartient vraisemblablement à diverses puces « thématiques » adaptées aux besoins particuliers des chercheurs ou des médecins. En ce qui concerne les glycoarrays ou biopuces à sucres, même si elles attirent beaucoup les scientifiques actuellement, cette technologie est encore dans sa phase de développement et de validation. Parmi les limitations et les défis, on trouve principalement : les sources disponibles de sucres, le développement de méthode d'isolement et de purification de nouveaux sucres à partir de sources naturelles, la mise en place de nouvelles synthèses.

C. Laboratoires sur puces

Le domaine des laboratoires sur puce constitue, depuis son origine, un domaine d'application très important de la microfluidique. Construits avec l'objectif ultime de l'intégration complète de la chaîne analytique, au niveau moléculaire ou cellulaire, ils contribuent à répondre à un besoin grandissant d'analyse automatique, rapide et à bas coût. Le potentiel de miniaturisation ultime de ces systèmes, leur richesse fonctionnelle permettent le rapprochement du lieu d'analyse au lieu de prélèvement et ouvrent ainsi un champ d'utilisation extrêmement vaste (chez le praticien, au lit du patient, en environnement isolé ou défavorisé...). Bien que les technologies microfluidiques aient atteint un degré de maturité suffisant pour permettre l'émergence d'applications extrêmement pertinentes, les laboratoires sur puces restent encore un domaine complexe où la recherche revêt de multiples facettes : technologies de fabrication, de fonctionnalisation, fonctionnalités nouvelles. Essentiellement conçus sur une base bidimensionnelle, ils évoluent vers des formes plus complexes, éventuellement 3D, de manière à optimiser le niveau d'intégration, mais également à satisfaire à de nouvelles exigences fonctionnelles. Des fonctions multiples (tri, séparation, amplification, assemblage sélectif, encapsulation, confinement, focalisation des bio-objets) sont encore à imaginer et implémenter que ce soit au niveau moléculaire ou cellulaire, que ce soit en flux continu ou en fluidique digitale. L'inflexion récente des demandes pour des dispositifs à bas coût, et éventuellement souples a suscité une transition importante, consistant à introduire de façon massive la matière organique voire biologique dans les filières technologiques concernées : couches moléculaires auto-assemblées, copolymères à blocs, substrats à dureté variable patternée, matériel génétique auto-organisé en origami ou organisé par assemblage spécifique (ADN/aptamères-protéines), vésicules (hydrogels, polymères, lipides, etc.), nanoparticules multifonctionnelles sont autant d'outils qui alimenteront la recherche dans les années à venir.

Bien que la recherche en dispositif d'analyse moléculaire soit encore particulièrement active, on peut noter une évolution notoire de la problématique vers le niveau cellulaire. Le diagnostic moléculaire connaît toutefois une forte dynamique dans le domaine émergent de la nanofluidique. Cette évolution permet les manipulations moléculaires aux échelles ultimes et servira tant le domaine du diagnostic que celui de la compréhension des systèmes biologiques en permettant de reconstituer des systèmes modèles mimant le vivant.

Un des champs d'application particulièrement actif porte sur la possibilité de travailler à l'échelle de la cellule unique. De par les très faibles volumes de liquide manipulé, il devient possible d'analyser de manière quantitative le contenu génétique ou protéique d'une seule cellule. Les approches récentes en microfluidique biphasique et notamment la possibilité d'encapsuler des cellules dans des gouttelettes aqueuses ouvrent des perspectives très intéressantes pour l'analyse à très haut débit et très haut contenu de populations cellulaires. La manipulation, le tri, la détection, l'étude de la croissance de cellules, qu'il s'agisse de cellules eucaryotes ou procaryotes, en gouttes ou en flux continu, sont des domaines de recherches très actifs.

Un autre champ de recherche concerne l'interaction de cellules vivantes avec leur environnement local ou microenvironnement. Ces études ouvrent des possibilités très intéressantes notamment dans le domaine de la cancérologie : il est désormais admis que le caractère invasif d'un cancer primitif est déterminé non seulement par le génotype des cellules tumorales, mais aussi par leurs interactions avec l'environnement extracellulaire qui module les capacités de développement de la tumeur. Le micro-environnement cellulaire est également central dans les mécanismes de différenciation de cellules souches et la possibilité de cribler à haut débit l'influence du micro-environnement sur la différenciation des cellules souches constitue également un défi majeur dans le domaine de la médecine régénérative qui vise à générer des organes et des tissus spécifiques à partir de cellules souches.

Enfin, les laboratoires sur puce s'imposent également comme un outil de choix pour étudier des interactions cellules-cellules. En neurosciences, par exemple, la possibilité de cultiver des neurones dans des environnements avec une topographie contrôlée permet d'étudier à la fois des mécanismes de propagation (virologie, thérapeutique) mais aussi d'étudier la connectivité et la plasticité neuronale. Cette dimension se prolonge jusqu'à l'échelle tissulaire. Plusieurs groupes français participent déjà à cet élan international vers la fabrication d'organes on-chip.