Section 16 Chimie du vivant et pour le vivant : conception et propriétés de molécules d'intérêt biologique

I. Analyse de biomolécules

Les défis à relever dans l'étude et l'analyse des biomolécules et de leurs fonctions biologiques concernent aussi bien la détermination de leur structure en solution dans un tube, que dans leur environnement naturel, en interaction avec leurs partenaires. Pour ce faire, des méthodes de détection et d'analyse doivent permettre d'atteindre des quantités de plus en plus faibles, voire de suivre une molécule à l'échelle de l'unité, et d'appréhender ses interactions avec une vision spatio-temporelle de plus en plus fine. De nouvelles techniques émergent régulièrement pour étudier les interactions moléculaires d'un point de vue thermodynamique et/ou cinétique, comme la thermophorèse à micro-échelle, la résonance plasmonique de surface (SPR et PWR) etc. Pour tous ces développements techniques, le chimiste est de plus en plus sollicité pour développer des sondes et marqueurs stables et au seuil de détection de plus en plus abaissé, afin de marquer et tracer les biomolécules, avec des marqueurs aux propriétés physico-chimiques en perpétuelle évolution (voir § IV A). Enfin, l'adaptation aux procédés physico-chimiques de détection, demande de développer l'interaction avec différents domaines de la physique expérimentale.

Parallèlement, les techniques d'analyse biophysique ne nécessitant pas de marquage des biomolécules pouvant interférer dans les mécanismes de reconnaissance, telles que la calorimétrie, la Résonance Magnétique Nucléaire (RMN) et la spectrométrie de masse connaissent actuellement un regain d'intérêt pour l'étude des interactions biomoléculaires. Ainsi, le développement des approches telles RMN et Polarisation Nucléaire Dynamique (DNP), imageries par spectrométrie de masse, infrarouge, Raman etc., sont en plein essor, malgré les verrous techniques liés à la sensibilité de détection, qui modèrent encore la pertinence biologique des observations. Les techniques nouvelles de DNP permettent en théorie une augmentation de la sensibilité de la spectroscopie RMN de 4 à 5 ordres de grandeur. Ce gain unique est mis à profit pour développer de nouvelles approches méthodologiques destinées à étudier dans le détail des cinétiques enzymatiques par exemple.

A. Biophysique : imagerie et molécules uniques

Les méthodes d'imagerie en développement comme la microscopie Raman SERS (spectroscopie Raman exaltée par une surface métallique) permettent de gagner en sensibilité de plusieurs ordres de grandeur (1014 à 1015 fois) et de détecter une molécule à l'échelle de la picomole dans une cellule. L'imagerie par spectrométrie de masse d'ions secondaires (NanoSIMS) est parfaitement adaptée pour mesurer, visualiser et quantifier la répartition des éléments et de leurs isotopes stables dans un échantillon chimique (environnement, patrimoine) ou à l'échelle sub-cellulaire dans un matériau biologique, avec des concentrations de l'ordre du ppm, voire même du ppb.

L'Imagerie par Résonance Magnétique nucléaire (IRM) est installée en clinique. Les prochains défis à relever seront d'améliorer encore les résolutions spatiales et temporelles, en particulier pour l'imagerie fonctionnelle, ainsi que le contraste pour améliorer la qualité des images et diminuer les doses injectées. Le développement d'agents de contraste dits « intelligents » (voir § IVA) améliorera également la localisation d'une biomolécule ou d'une fonction particulière. Un autre volet relève de la portabilité des spectromètres/imageurs qui généralisera leur utilisation au plus près de la source d'échantillon.

L'imagerie par Résonance Paramagnétique Électronique (RPE), quant à elle, permet la cartographie des espèces paramagnétiques dans un organisme vivant en superposant des images moléculaires RPE sur des images anatomiques plus classiques (tomographie X...). Des applications de l'IRPE en biologie et en spectroscopie clinique sont attendues dans un futur proche et cette technique pourrait devenir une nouvelle méthode d'imagerie non invasive complémentaire de l'IRM.

La fluorescence, de par son aspect non invasif et non destructeur dans les cellules et les organismes, fait certainement de ce moyen d'imagerie la technique de choix pour l'analyse des molécules uniques ou des interactions moléculaires. Cette technique couramment usitée pour suivre un phénomène in vitro, permet aussi de suivre un phénomène in cellula (localisation d'une cible biologique) et in vivo (localisation, diagnostic...) grâce à sa sensibilité et à sa résolution spatiale et temporelle.

Les approches à l'échelle de la molécule unique sont d'un grand intérêt pour comprendre les mécanismes moléculaires associés aux fonctions biologiques des biomolécules. Elles concernent les techniques d'imagerie en général, notamment fluorescence par super-résolution et de transfert d'énergie par résonance de type Förster (FRET), microscopie en ondes évanescentes ou microscopie à force atomique. L'usage de plus en plus étendu des nanopores donne par ailleurs un cadre unique de plate-forme appropriée pour les capteurs à molécule unique afin d'étudier les réactions chimiques, la reconnaissance biomoléculaire et les interactions électrostatiques à l'échelle nanométrique.

Les appareils de mesure de force (Biomembrane Force Probe, BFP) permettent par ailleurs la quantification de liaisons moléculaires simples, dans un large éventail de forces (0,1 pN à 1 nN) qui permettent d'étudier des interactions à l'échelle de la molécule unique. Les mesures de forces d'interactions biomoléculaires sont aussi étudiées par AFM.

B. Biologie structurale intégrative

La biophysique contribue également à la caractérisation structurale et dynamique à haute résolution des biomolécules et de leurs interactions avec des ligands. La biologie structurale a récemment évolué vers des approches intégratives où la complémentarité de plusieurs techniques, expérimentales mais aussi théoriques (modélisation, simulation), est exploitée pour fournir une description globale d'un même système biologique. En parallèle, chaque technique continue à vivre des avancées en méthodologie et instrumentation. Grâce à des détecteurs plus sensibles et plus rapides, la diffusion des rayons X aux petits angles (SAXS) résolue en temps pourra contribuer à donner une dimension cinétique aux changements conformationnels. La biocristallographie arrive maintenant dans une ère où la taille des cristaux n'est plus un critère majeur et le développement des lasers à électron libre (XFEL) extrêmement brefs et lumineux ouvre des perspectives nouvelles pour la détermination de structure de molécules uniques. La résolution accessible en cryomicroscopie va continuer à se rapprocher de celle obtenue par diffraction des rayons X et ceci pour des objets de plus en plus petits. De par sa capacité à fournir des informations interatomiques sur de longues distances, la RPE impulsionnelle associée à la technique de marquage de spin va également contribuer à affiner la construction de modèles structuraux d'assemblages protéiques. L'introduction de données de SAXS, RMN, RPE ou FRET dans les protocoles de modélisation moléculaire va fournir des ensembles conformationnels qui amélioreront notre compréhension des biomolécules en général et plus particulièrement des protéines intrinsèquement dépliées.

C. RMN

Bien que la RMN souffre d'une faible sensibilité intrinsèque, les progrès technologiques et conceptuels continus (préparation d'échantillons, champs magnétiques, sondes ou séquences d'impulsions) rendent possibles l'étude de molécules disponibles toujours en plus faible quantité, ou des noyaux naturellement peu abondants ou de bas rapport gyromagnétique.

La RMN joue un rôle toujours prépondérant pour la caractérisation moléculaire en chimie de synthèse ou des substances naturelles. Étant très sensible aux interactions moléculaires, elle a également un apport conséquent en chimie médicinale aux cours des différentes étapes de développement de molécules thérapeutiques. Les avancées récentes rendent aussi possible l'étude de molécules dans des environnements complexes, avec un intérêt pour des molécules ne pouvant être purifiées ou pour caractériser ces molécules dans leur environnement natif. De même, l'amélioration des approches métabolomiques facilitera et accélérera le diagnostic et le traitement au plus près du lit du patient. Des progrès importants sont aussi à attendre du côté des sondes RMN de surface et de leur miniaturisation, ce qui rendra potentiellement caduque la nécessité de prélèvements.

La RMN représente une technique de choix dans le contexte de la biologie structurale intégrative et va continuer à apporter des contributions majeures dans la compréhension du rôle des constituants cellulaires. Les avancées techniques majeures comme la deutération et le marquage isotopique spécifique des méthyles ont récemment contribué à lever en grande partie la limite de poids moléculaire accessible. Une des forces de la RMN est sa capacité à sonder des états multiples de biomolécules et elle donne accès par exemple aux états transitoirement et faiblement peuplés dont le rôle dans les phénomènes de repliement de protéines, de mécanismes enzymatiques et de reconnaissance moléculaire s'avère capital. La RMN s'est récemment positionnée au centre des études structurales et dynamiques des protéines intrinsèquement dépliées dont le rôle central dans la régulation des phénomènes cellulaires est établi, et des études de biomolécules dans l'environnement cellulaire, natif quand cela est possible. L'application de la RMN du solide en biologie structurale est aussi en pleine phase de développement, en particulier pour l'étude des assemblages moléculaires.

Au-delà des coûts induits, notamment pour les très hauts champs magnétiques, l'intégration et le positionnement de la technique dans les nombreux courants en chimie et biologie représentent le défi principal de la RMN, et un haut niveau de développement méthodologique sera requis pour répondre aux questionnements toujours évolutifs.

D. Modélisation moléculaire

La modélisation occupe une position clé à l'interface entre physique, chimie et biologie. Elle accompagne souvent les études expérimentales, donnant des indications précieuses non seulement pour comprendre les mécanismes moléculaires fondamentaux liés aux fonctions des macromolécules biologiques (protéines, acides nucléiques, lipides, glycanes) et à leurs interactions avec leurs partenaires, mais aussi pour concevoir des stratégies novatrices pour réguler l'ensemble de ces mécanismes.

Deux aspects complémentaires nourrissent cette discipline, qui fait souvent appel à des compétences pluridisciplinaires (chimie, physique théorique, informatique, statistique, biologie...) : d'une part des développements méthodologiques, nourris par les questions biologiques et, d'autre part, des actions d'analyse, de structuration, de classification, d'exploitation et de valorisation de l'ensemble des données, souvent très hétérogènes et de plus en plus nombreuses.

La chémo-informatique et la bioinformatique sont au cœur de ces activités, et les thématiques abordées sont très diverses, allant de l'analyse des séquences des protéines solubles et membranaires et de la prédiction de leurs structures jusqu'aux approches permettant l'amarrage et le criblage de petites molécules (criblage in silico, § IIIA2). Les aspects de dynamique moléculaire prennent de plus en plus d'ampleur dans ce champ grâce à l'augmentation des moyens de calcul et au développement de modèles physiques appropriés, permettant désormais d'avoir accès à des mécanismes clés comme le repliement, la liaison de ligands ou des changements conformationnels, même subtils au niveau d'un ou deux résidus des sites actifs. Ces avancées, couplées au développement et à l'application de diverses méthodes d'exploration de l'espace énergétique, de calcul d'énergie libre et de modèles simplifiés gros grains, permettent la mise en place d'approches multi-échelles. À l'interface avec la biologie structurale expérimentale, des méthodologies corrélatives sont également développées pour coupler les résultats obtenus à différentes résolutions par un ensemble de techniques (voir § II B). Des développements spécifiques voient aussi le jour sur le plan de la bioinformatique pour étudier la dynamique de complexes ou de structures particulières (protéines intrinsèquement dépliées, agrégats, complexes membranaires...) par différentes techniques d'exploration de l'espace conformationnel et/ou d'analyse d'images en couplage avec des données expérimentales.

E. Spectrométrie de masse

De nombreuses stratégies d'analyse en chimie et biologie font intervenir la spectrométrie de masse pour caractériser une palette de molécules de plus en plus étendue, des composés de petite taille aux assemblages supramoléculaires.

Les performances constamment accrues en sensibilité et vitesse d'acquisition des spectromètres de masse ont permis des avancées déterminantes, notamment en analyse protéomique et lipidomique. Le développement de logiciels performants a récemment favorisé la quantification non ciblée des protéines dans des mélanges complexes. La phase de découverte des approches « omiques » reste active, mais les phases de caractérisation et d'analyse quantitative absolue ont pris une importance croissante. Dans ce dernier cas, la capacité de la spectrométrie de masse à réaliser des dosages de composés présents à l'état de traces (attomoles) dans des matrices très complexes représente un atout majeur (notamment avec les besoins croissants en analyse métabolomique).

La caractérisation intégrale de protéines, incluant l'état précis de leurs modifications post-traductionnelles est devenue un objectif stratégique dans de nombreuses thématiques de recherche. L'approche bottom-up (des fragments peptidiques à la protéine entière) est de plus en plus souvent complétée par une approche top-down (partant de la protéine intacte) rendue compatible avec l'analyse de mélanges complexes de protéines. L'analyse de complexes non covalents a également continué à progresser dans le cas des protéines et des acides nucléiques. Dans ce domaine de la caractérisation structurale d'assemblages supramoléculaires, des stratégies mettant en œuvre la spectrométrie de masse dite supramoléculaire ou « native », associée à l'analyse de la mobilité ionique d'une part, et à l'échange isotopique hydrogène/deutérium ou l'utilisation de réactifs de réticulation de plus en plus spécifiques et efficaces d'autre part, ont permis de réaliser des progrès substantiels.

L'imagerie moléculaire par spectrométrie de masse a connu une phase de maturation d'une dizaine d'années, accompagnée de l'apparition de nouvelles méthodologies, complémentaires des modes MALDI et SIMS, et est devenue une méthodologie clé de l'imagerie de tissus avec entre autres des applications en santé humaine et en analyse environnementale.

Les laboratoires français se sont illustrés à la pointe de la recherche internationale impliquant des stratégies d'analyse qui reposent sur la mise en œuvre de la spectrométrie de masse. D'une manière logique, dans un contexte d'obsolescence rapide (environ cinq ans) des spectromètres de masse, des plate-formes associées de manière dynamique à une structure de recherche innovante ont un rôle de plus en plus important dans ces travaux de recherche.